Cultura celulară este unul dintre cele mai importante instrumente utilizate în biologia celulară și moleculară, oferind un sistem model excelent pentru studiul fiziologiei și biochimiei normale (de exemplu, studii metabolice, îmbătrânirea), efectele medicamentelor și compușilor toxici asupra celulelor, precum și efectele a mutagenezei și carcinogenezei celulare. De asemenea, este utilizat în screening-ul și dezvoltarea medicamentelor și în producția pe scară largă de compuși biologici (de exemplu, vaccinuri, proteine terapeutice). Un avantaj major al utilizării culturii celulare pentru oricare dintre aceste aplicații este consistența și reproductibilitatea rezultatelor care pot fi obținute prin utilizarea unui lot de celule clonale.
cultură de celule
Cultura celulară se referă la îndepărtarea celulelor de la animale sau plante și creșterea lor într-un mediu artificial favorabil. Celulele pot fi îndepărtate direct din țesut și disociate enzimatic sau mecanic înainte de cultură sau pot fi derivate din linii celulare sau tulpini stabilite.
1. Pregătire primară
Cultura primară se referă la stadiul de cultură după ce celulele au fost izolate din țesut și propagate în condiții adecvate până când ocupă tot substratul disponibil (adică, ajung la confluență). În această etapă, celulele trebuie să fie subcultivate (adică, trecute) prin transferarea lor într-un nou recipient cu mediu de creștere proaspăt pentru a oferi mai mult spațiu pentru creșterea continuă.
2. Liniile celulare
După prima subcultură, culturile primare se numesc linii celulare sau subclone. Liniile celulare derivate din culturi primare au o durată de viață finită (adică sunt finite) și atunci când sunt trecute predomină celulele cu cel mai mare potențial de creștere, rezultând un grad de uniformitate genotipică și fenotipică în sexul populației.
3. Liniile celulare
O linie celulară devine o tulpină celulară dacă o subpopulație a liniei celulare este selectată activ din cultură prin clonare sau alte metode. Liniile celulare dobândesc adesea modificări genetice suplimentare după ce linia parentală a fost inițiată.
4. Linii celulare limitate și linii celulare continue
Celulele normale se divid de obicei doar de un număr limitat de ori înainte de a-și pierde capacitatea de a prolifera, un eveniment determinat genetic numit senescență; aceste linii celulare se numesc finite. Cu toate acestea, unele linii celulare devin nemuritoare printr-un proces numit transformare, care poate avea loc spontan sau poate fi indus chimic sau viral. O linie celulară finită devine o linie celulară continuă atunci când suferă o transformare și dobândește capacitatea de a se diviza la infinit.
Liniile celulare cultivate în mod continuu sunt predispuse la derive genetică, liniile celulare finite sunt sortite îmbătrânirii, toate culturile celulare sunt susceptibile la contaminarea microbiană și defecțiunile echipamentelor pot apărea chiar și în laboratoarele cele mai bune. Deoarece liniile celulare stabilite sunt o resursă valoroasă a cărei înlocuire este costisitoare și consumatoare de timp, este esențial să le crioconservați pentru depozitare pe termen lung.
Odată ce un număr mic de celule rămase sunt obținute din subcultură, acestea trebuie congelate ca stoc de semințe și protejate de utilizarea generală în laborator. Stocurile de lucru pot fi pregătite și completate din stocurile de semințe congelate. Dacă stocul de semințe este epuizat, atunci stocul de lucru crioconservat poate fi folosit ca sursă pentru prepararea stocului de semințe proaspete, producând o creștere minimă a cantității de la înghețarea inițială.
Cel mai bun mod de a crioconserva celulele cultivate este în azot lichid, în mediu complet, în prezența unor crioprotectori precum dimetil sulfoxid (DMSO) sau glicerol. Crioprotectorii scad punctul de îngheț al mediului și, de asemenea, reduc viteza de răcire, reducând foarte mult riscul formării de cristale de gheață, care pot deteriora celulele și pot duce la moartea celulelor.
Se știe că DMSO facilitează intrarea moleculelor organice în țesuturi. Când se manipulează reactivi care conțin dimetil sulfoxid, trebuie utilizate echipamente și practici adecvate pentru pericolele acestui material. Aruncați reactivii conform reglementărilor locale.
Creșteți celule din stocurile de celule de lucru congelate
Asigurați-vă că completați jurnalul de servicii bancare mobile
Determinați numărul de pasaje, de exemplu, dacă celulele anterioare au fost înghețate și au fost dezghețate de trei ori, procesul de dezghețare ar fi al patrulea pasaj.
Adăugați medii de creștere (medii minime, ser de vițel și antibiotice) în baloanele T75 etichetate cu linia celulară, numărul de trecere și data
Puneți balonul pe orizontală într-un incubator cu CO la 37 de grade și 5% CO pentru cel puțin 15 minute. Acest lucru va încălzi mediul și îl va aduce la pH-ul normal (7.0-7.6)
Dezghețați flacoanele congelate cu linii celulare într-o baie de apă la 37 de grade cu agitare ușoară. Pentru a reduce riscul de contaminare, mențineți inelul O și capacul deasupra nivelului apei (2-5 minute).
Puneți flaconul într-un dulap de siguranță biologică (BSL-2). Pentru a evita contaminarea, ștergeți cu 70% etanol înainte de a deschide flaconul.
Transferați conținutul balonului cu celule congelate într-un balon T75 care conține mediu de creștere. Se amestecă și se agită ușor balonul pentru a distribui uniform celulele pe suprafața balonului.
Incubați balonul peste noapte într-un incubator cu CO2 la 37 de grade cu 5% CO2. Lăsați celulele să se atașeze peste noapte
schimbarea mediului de creștere
Incubați balonul pentru încă 2-4 zile la 37 de grade, 5% CO2 și monitorizați până când celulele cresc
Odată ce celulele ating aproximativ 90 la sută confluență, stocul de celule poate fi extins folosind un balon T150