Astăzi, să vorbim despre un element cheie în experimentele PCR - consumabilele. Ca vizitator frecvent al PCR, este necesar să înțelegeți caracteristicile și terminologia referitoare la consumabilele PCR.
Pe piață există o mare varietate de consumabile PCR, inclusiv mărci, specificații, culori etc., care sunt orbitoare. Să înțelegem pas cu pas.
placa pcr
1. Materiale
De obicei, materia primă a consumabilelor PCR este polipropilena. Este un bun material inert rezistent la căldură. Intervalul de temperatură de lucru este de la -30 la 140 de grade, ceea ce îi permite să reziste la schimbările de energie termică în timpul ciclului termic al reacției PCR și joacă un rol bun în etanșarea și protejarea substanțelor din sistemul de reacție PCR.
Aflați mai multe despre polipropilenă
2. Culoare
Cele comune sunt tuburile albe și tuburile PCR transparente. În experimentele PCR tradiționale, nu există nicio diferență între cele două. Cu toate acestea, în același experiment în timp real/qPCR, tuburile albe au fost relativ mai sensibile și mai consistente pentru instrumentele qPCR cu citiri de semnal apicale (a se vedea figurile A și B de mai jos). de ce este asa?
tub pcr
A: valori mai mici Ct pentru tuburile albe comparativ cu tuburile transparente; B: repetabilitate mai bună cu tuburi albe.
Datele de bază ale qPCR sunt valoarea Ct, iar semnalul de fluorescență este sursa de date pentru calcularea valorii Ct, deci este foarte important dacă fluorescența din tub poate fi transmisă complet la detector. Peretele tubului alb previne trecerea fluorescenței prin peretele tubului și refracția (Figura A de mai jos), împiedicând astfel transmiterea fluorescenței către blocul de încălzire (adică, peretele orificiului metalic în care este plasat tubul) și absorbția. sau reflectat inconsecvent de bloc. Un semnal fluorescent mai puternic și mai concentrat a fost colectat la vârful tubului alb în comparație cu tubul transparent (Figura B de mai jos).
tub pcr
R: Tendința de schimbare a semnalului de fluorescență în tubul transparent și tubul alb; B: Comparația intensității fluorescenței după adăugarea aceleiași cantități de fluoresceină.
Deci, dacă utilizați un instrument qPCR cu citire superioară, încercați tuburi albe.
3. Calitate (Lean sau Not Lean)
Aici se subliniază importanța calității consumabilelor. Consumabilele qPCR trebuie să fie lipsite de contaminanți și inhibitori. Presiunea ridicată și radiațiile îndepărtează bacteriile și ADNazele, dar nu praful și reziduurile de ADN, care pot inhiba reacțiile PCR sau pot produce amplificare nespecifică. Substanțele au absorbanță și chiar și poluanții mici vor absorbi fluorescența în sistemul de reacție și vor afecta colectarea semnalelor de fluorescență. O versiune exagerată a experimentului a fost folosită pentru a demonstra efectul contaminării cu impurități asupra experimentului. După cum se arată în figura de mai jos, o impuritate a fost plasată într-unul dintre godeurile de reacție ale octavei. După cum era de așteptat, curbele de amplificare au prezentat anomalii marcate.
Impurități în tuburile de reacție PCR
↑ Impurități în tubul de reacție
8 benzi
↑ Rezultatele reacției repetate pentru 8 tuburi, impuritatea din puțul din stânga „abate” curba.
Memento: Aveți grijă să nu expuneți consumabilele la aer pentru o perioadă lungă de timp. După ce ați scos consumabilele, asigurați-vă că sigilați rapid punga de ambalare pentru a evita atingerea acestuia cu mâinile goale. Dacă este posibil, lucrați pe o bancă curată.
4. Capacitate / Dimensiune / Flux
Volumul determină câtă probă (volum de reacție) poate fi încărcată. Supradozajul poate duce la reducerea eficienței transferului de căldură, scurgeri sau contaminare încrucișată; subdozarea poate duce la pierderea evaporativă a probei. Blocul de încălzire al instrumentului qPCR va determina, de asemenea, consumabilele aplicabile și dimensiunea aplicabilă a sistemului de reacție. Debitul este ușor de înțeles, este numărul maxim de mostre care pot fi încărcate într-un singur experiment. Specificațiile comune privind capacitatea și fluxul sunt prezentate în tabelul de mai jos:
Tub unic/opt rânduri {{0}},2 ml, 0,1 ml
{{0}}placă de godeuri 0.2mL, 0.1mL
{{0}}placă de godeuri 0,2 ml
Specificațiile de capacitate sunt, de asemenea, împărțite în tipuri standard și reduse, după cum se arată mai jos. Consumabilele cu profil redus au o înălțime mai mică. Acest design scurt minimizează spațiul de deasupra sistemului de reacție („volum mort” - partea inutilă), reduce efectele evaporării în timpul ciclării termice și permite modulului de încălzire să se înfășoare într-o măsură mai mare pentru a îmbunătăți eficiența transferului de căldură. Prin urmare, tuburile cu profil redus sunt cunoscute și ca tuburi sau plăci „rapide”.
tub pcr
Memento: volumul de reacție utilizat în mod obișnuit este de 20 µL și se recomandă utilizarea unui tub de reacție cu volum mic de 0,1 ml sau un volum mic.
5. Grosimea peretelui
Grosimea peretelui tubului afectează direct conductivitatea termică. Consumabilele PCR trebuie să aibă o grosime uniformă a peretelui pentru a asigura un transfer consistent de căldură. Peretele tubului ultra-subțire este cu 50 la sută mai subțire decât versiunea standard, ceea ce reduce și mai mult bariera termică și aduce efecte de răspuns mai rapide și mai bune. Prin urmare, pentru a maximiza eficiența reacțiilor PCR și a asigura reacții stabile și eficiente, consumabilele PCR uniforme și ultra-subțiri sunt cea mai bună alegere.
6. Transparență
Capacele și filmele de etanșare pentru qPCR necesită o claritate optică ridicată pentru a asigura penetrarea și transmisia optime a semnalelor fluorescente, reducând în același timp distorsiunea (pentru instrumentele qPCR cu citire superioară). Cu cât este mai mare transparența peretelui tubului, aceasta poate afecta rezultatele experimentale. Motivul a fost explicat mai sus. PCR tradițională poate ignora această caracteristică.
7. Fuste
Fusta unei plăci PCR se referă la prelungirea periferică a plăcii. La construirea sistemelor de reacție, manta acționează ca un suport stabil pentru procesele de pipetare și oferă rezistență mecanică și aderență atunci când este combinată cu stații de lucru automate. Există trei tipuri comune de fuste, fuste semi și fuste pline (corespunzând cu A, B și C din figura de mai jos).
Fără fustă: poate fi utilizat cu majoritatea instrumentelor PCR sau qPCR, dar nu și pentru aplicații automate. Ușor de mutat în timpul pipetării, nu foarte stabil, trebuie utilizat cu un suport pentru plăci.
Jumătate de fuste: Ideal pentru aplicații automate cu stabilitate bună la pipetare.
Placă cu fustă completă: ideală pentru aplicații automate. Rezistență mecanică bună, potrivită pentru instrumente PCR cu module proeminente, stabilitate ridicată în timpul pipetării.
placa pcr
Sfaturi: Semnificația fustei este mai mult de a facilita industrializarea și procesarea automată a loturilor, combinată cu brațul robotizat. Este posibil să nu fie necesar în laboratoarele de cercetare tradiționale, nici o fustă nu este suficientă.
placa pcr
8. Parafilm
Filmul de etanșare a plăcii PCR este fabricat din plastic transparent sau folie de aluminiu. Filmele adezive transparente sunt mai frecvente, potrivite pentru plăci cu 96 sau 384 de godeuri și ar trebui să aibă o transmisie a luminii suficient de bună. Când sigilați filmul, se va folosi un card mic pentru a presa filmul în jurul orificiului de etanșare pentru a evita scurgerea de aer.
Filmele adezive din aluminiu pot fi mai puțin frecvente. Deși nu este potrivit pentru qPCR, este consumabilul ideal pentru probele sensibile la lumină. Deoarece poate fi perforat, facilitează transferul probei în PCR (pentru PCR convențional).
Film de etanșare a plăcii PCR
Rezuma
În calitate de purtător al sistemului PCR, consumabilele sunt foarte importante pentru îmbunătățirea calității datelor experimentale. Sper că această partajare vă poate ajuta să înțelegeți câteva sfaturi despre consumabilele PCR și să vă ofere ajutor pentru o mai bună selecție a consumabilelor.