În era post-epidemică, termenul „testare a acidului nucleic” este familiar tuturor și a devenit o parte a vieții noastre de zi cu zi.
Deci, știți cum testele de acid nucleic detectează virușii? Și cum testarea acidului nucleic face virușii invizibili „vizibili”?
01 Ce este acidul nucleic
Acidul nucleic este termenul general pentru ADN și ARN.
Acidul nucleic este o componentă esențială a întregii vieți cunoscute de pe pământ. ADN-ul pe care îl spunem adesea este acid dezoxiribonucleic. Materialul genetic al noului coronavirus este ARN - acid ribonucleic.
Testarea de amplificare a acidului nucleic
02 Ce detectează exact testarea acidului nucleic?
Substanța pentru detectarea acidului nucleic este acidul nucleic al virusului.
Noul coronavirus este un virus care conține doar ARN, iar secvența specifică de ARN din virus este un marker care distinge virusul de alți agenți patogeni. Detectarea acidului nucleic este pentru a afla dacă există acid nucleic al virusului invadator străin în specimenul respirator al pacientului sau în sânge pentru a determina dacă acesta este infectat cu noul coronavirus. Marea majoritate a detectării actuale a acidului nucleic a noului coronavirus utilizează metoda PCR cantitativă fluorescentă pentru a amplifica secvența țintă a ARN viral prin PCR după transcrierea inversă.
PCR, sau reacția în lanț a polimerazei, este o tehnică de biologie moleculară folosită pentru a amplifica fragmente specifice de ADN; se referă la reacția catalizată de ADN polimerază a unor gene specifice sau Reacția de amplificare rapidă in vitro a secvențelor de ADN se mai numește și amplificare genică in vitro. Tehnologia PCR cantitativă fluorescentă este de a adăuga un sistem reporter fluorescent la sistemul de reacție PCR și de a utiliza schimbarea semnalului fluorescent pentru a monitoriza procesul PCR în timp real, astfel încât să realizeze detectarea cantitativă a șablonului inițial.
Pentru a detecta acidul nucleic, primul pas este colectarea unei probe. În prezent, cea mai convenţională metodă de prelevare este: folosirea tampoanelor de gât sau nazale pentru a şterge şi colecta căile respiratorii superioare (faringe sau cavitatea nazală); probele colectate vor fi sigilate strict și apoi trimise la laborator pentru testare graduală.
1. Extragerea ARN viral
ARN-ul virusului este mai întâi extras din probă. Adăugați reactivi de extracție a acidului nucleic la probă pentru a distruge virusul și a elibera acidul nucleic.
2. „Transcripția inversă” a ARN-ului viral în ADNc
Prin tehnologia de transcripție inversă (RT), ARN-ul virusului este „inversat” într-un ADN specific care este mai convenabil de detectat, adică ADNc.
3. Amplificarea și detectarea cADN-ului
De fapt, fie că este vorba de tampon de gât, de tampon nazal sau chiar de prelevare de sânge, conținutul de virus din probă este relativ scăzut, chiar și la pacienții grav infectați (încărcătura virală este mare); deoarece particulele de virus sunt prea mici și volumul de eșantionare este limitat, numărul de virusuri conținute în probă este încă prea mic pentru detectarea acidului nucleic.
Prin urmare, folosind tehnologia PCR, inspectorii amplifică „parola” unică a noului coronavirus din probă până la punctul în care echipamentul îl poate detecta, astfel încât să judece dacă este o infecție pozitivă. Întregul proces de preluare a materialului genetic al virusului este ca pescuitul. Cârligul îl va identifica și îl va apuca, astfel încât virusul să nu aibă unde să se ascundă.
Mai simplu spus, este de a amplifica numărul de ADNc, astfel încât ADNc-ul să fie replicat continuu, astfel încât numărul să crească exponențial.
Procesul PCR standard este împărțit în trei etape:
Denaturare: Utilizarea temperaturii ridicate pentru a separa catenele duble ale ADN-ului. Legăturile de hidrogen dintre catenele duble de ADN sunt rupte la temperatură ridicată (93 - 98 grade ).
Recoacere: După ce catenele duble de ADN s-au separat, temperatura este coborâtă pentru a permite primerilor să se lege de ADN-ul simplu catenar.
Extensie: ADN polimeraza sintetizează o catenă complementară de-a lungul catenei de ADN de la primer legat atunci când temperatura este scăzută. Când alungirea este completă, un ciclu este încheiat și numărul de fragmente de ADN se dublează. Repetați acești trei pași de 25-35 ori, iar numărul fragmentelor de ADN va crește exponențial.
Șablon PCR dublu catenar
În timp ce cADN-ul este amplificat, sondele fluorescente din kit funcționează simultan. Va elibera un semnal fluorescent și de fiecare dată când cADN-ul este amplificat, semnalul fluorescent va crește puțin, iar detectorul PCR poate înregistra o valoare Ct a unei creșteri a semnalului fluorescent.
Valoarea Ct este un indicator important pentru a aprecia dacă acidul nucleic al virusului este negativ sau pozitiv. Cu cât mai puțin ADN inițial, cu atât sunt necesare mai multe cicluri PCR pentru a atinge un anumit prag și cu atât valoarea Ct este mai mare. În schimb, cu cât mai mult ADN inițial, cu atât valoarea Ct este mai mică. Cantitatea inițială de ADN reflectă cantitatea de ARN viral din probă, care, la rândul său, reflectă cantitatea de virus din probă. Prin urmare, dacă valoarea Ct nu este detectată sau este mai mare decât o anumită valoare, atunci pacientul suspectat este considerat negativ; dacă este mai mică decât această valoare, atunci pacientul suspectat este considerat pozitiv.
În timpul reacției PCR, selecția consumabilelor PCR este, de asemenea, unul dintre cei mai importanți factori care afectează rezultatele detectării acidului nucleic.
