Ce este cultura celulară?
cultură de celule
Cultura celulară se referă la procesul de creștere a celulelor în condiții controlate în afara mediului lor natural. Este un instrument in vitro care facilitează înțelegerea biologiei celulare și a mecanismelor bolii. De asemenea, joacă un rol în descoperirea medicamentelor, cum ar fi testarea toxicității medicamentelor și studiile farmacocinetice/farmacodinamice, precum și medicina personalizată.
Embriologul american Ross Granville Harrison a dezvoltat primele tehnici de cultură celulară in vitro la începutul secolului al XX-lea, când a crescut cu succes fragmente de țesut din embrioni de broaște in vitro. Astăzi, cultura celulară a ajutat la nenumărate descoperiri, cum ar fi dezvoltarea de vaccinuri împotriva poliomielitei, rujeolei, oreionului și a altor boli infecțioase.
Cultura de aderență și suspendare
Există două sisteme de bază pentru creșterea celulelor: cultura aderentă și cultura în suspensie. Culturile aderente sunt crescute pe substraturi artificiale, în timp ce celulele din culturile în suspensie plutesc liber în mediu. În timp ce doar câteva tipuri de celule cresc în mod natural în suspensie (de exemplu limfocite), multe tipuri de celule aderente pot fi adaptate la cultura în suspensie.
Există două motive pentru cultivarea celulelor aderente în mod natural în suspensie. Primul avantaj al culturii în suspensie este că celulele sunt mai ușor de trecut, deoarece nu trebuie să le disociezi enzimatic sau mecanic de vasul de cultură. În al doilea rând, culturile în suspensie sunt mai ușor de extins, deoarece creșterea celulelor este limitată doar de concentrația lor în mediu, nu de suprafața disponibilă. Principalul dezavantaj al culturilor în suspensie este că necesită numărătoare zilnică de celule și teste de viabilitate pentru a urma modelele de creștere, în timp ce culturile aderente pot fi examinate cu ușurință la microscop.
Metode 2D și 3D
Culturile aderente pot fi împărțite în continuare în culturi 2D și 3D. În aplicațiile 2D, celulele aderente sunt crescute într-un sistem monostrat pe o suprafață plană, cum ar fi într-un balon de cultură celulară.
cultură de celule
Datorită simplității sale, tehnologia 2D nu poate imita mediul in vivo al celulelor, care de obicei cresc în structuri tridimensionale cu interacțiuni complexe de la celulă la celulă. Acesta este motivul pentru care unele experimente sunt efectuate folosind culturi 3D care pot fi cultivate folosind tehnologii bazate pe schele sau fără schele.
Metodele 3D bazate pe schele implică de obicei creșterea celulelor aderente în schele cu hidrogel. Alternative precum schele bioceramice, metalice sau polimerice sunt, de asemenea, folosite pentru unele aplicații.
Tehnicile fără schele sunt folosite pentru a crește sferoizii prin una dintre cele trei metode diferite:
Flotare forțată: Încărcați suspensia celulară în godeurile unei microplăci acoperite cu polimer cu aderență scăzută. Microplaca este apoi centrifugată pentru a forța celulele să formeze sferoizi.
Picătură suspendată: suspensia celulară este încărcată în godeurile unei plăci de picătură suspendată. După cum sugerează și numele, suspensia va atârna pe farfurie sub formă de picături. Celulele se vor agrega la vârfurile acestor picături și vor forma sfere.
Pe bază de agitație: suspensia celulară este plasată într-un bioreactor rotativ. Din cauza agitației constante, celulele nu au putut adera la pereți, formând astfel sferoizi.
Provocarea culturii celulare
În ciuda diferențelor de metode și tehnici, toate experimentele au un lucru în comun: este dificil să crești celule vii în numărul necesar pentru a obține rezultate reproductibile. Prin urmare, următoarele secțiuni vor fi dedicate celor patru provocări - repetabilitate, contaminare, fezabilitate și tranziția la automatizare.
reproductibilitatea
Potrivit unui sondaj realizat de Yongyue Medical, peste 70% dintre oamenii de știință au raportat că nu au reușit să reproducă experimentele unui alt om de știință și mai mult de jumătate nu au reușit să-și reproducă propria lucrare. În testele de cultură celulară, cele mai multe probleme de reproductibilitate apar din diferențele biologice dintre pasajele sau generațiile celulare. O altă mare problemă este identificarea greșită a liniilor celulare, iar inconsecvențele în parametrii culturii joacă, de asemenea, un rol important.
variatie biologica
Factori precum mutațiile aleatoare sau erorile de transcripție au potențialul de a afecta reproductibilitatea experimentelor de fiecare dată când o celulă se divide. Pentru a evita acest lucru, ar trebui să creați o bancă de celule la începutul unui nou proiect.
banca de celule
Banca de celule se referă la procesul de stocare a unor loturi de tipuri de celule specifice pentru a fi utilizate ulterior pentru a evita factori precum mutațiile aleatorii sau erorile de transcripție care afectează reproductibilitatea. Primul pas este de a stabili o bancă de celule master (MBC) prin creșterea unor tipuri de celule selectate de interes în cultură și crioconservarea lor în mai multe containere. Loturile de MBC sunt dezghețate și utilizate ulterior pentru a pregăti băncile de celule de lucru (WBC).
Identificarea greșită a liniilor celulare
Problema identificării greșite a liniei celulare este cunoscută încă din anii 1960, când un om de știință a descris contaminarea cu celule HeLa a altor 19 linii celulare umane. Pentru a vă asigura că rezultatele dumneavoastră sunt de încredere și, mai important, că nu trageți concluzii false, ar trebui să puneți în carantină toate liniile celulare noi care intră în laborator până când originea lor a fost verificată. Cel mai important, se recomandă repetarea calificării liniei celulare înainte de crioconservare și distribuție către alte laboratoare și după finalizarea proiectului. Pentru a verifica o linie celulară, ar trebui să verificați mai întâi dacă aceasta este listată în registrul liniei celulare identificate greșit. Dacă nu este înregistrată, trebuie totuși să-i confirmați autenticitatea. Pentru liniile celulare umane, se recomandă analiza scurtă în tandem (STR) (amprentă ADN). Sunt disponibile o varietate de metode de testare pentru liniile celulare non-umane, inclusiv cariotiparea, analiza izoenzimelor și tiparea ADN mitocondrial (cod de bare ADN).
Parametrii de cultură
Un al treilea factor care afectează reproductibilitatea sunt parametrii de cultură.
De exemplu, nivelurile de oxigen pot afecta semnificativ celulele cultivate. Cu toate acestea, variabilele care afectează oxigenarea, cum ar fi dimensiunea camerei sau densitatea celulelor, nu sunt întotdeauna documentate și, prin urmare, nu pot fi menținute consecvente.
Un alt parametru important de cultură este mediul. Aceasta oferă nutrienți esențiali, factori de creștere și hormoni și reglează pH-ul și presiunea osmotică. Prin urmare, cel mai important lucru este că compoziția sa este întotdeauna aceeași. Acest lucru este deosebit de critic pentru formulările medii suplimentate cu ser fetal bovin (FBS), a căror compoziție depinde de factori precum dieta vacii, locația geografică și perioada anului. Pentru a minimiza efectul FBS asupra reproductibilității rezultatelor, ar trebui să comandați diferite loturi de ser atunci când stocurile curente încep să se epuizeze și să le testați pentru a găsi cea mai apropiată potrivire. Pentru ca alții să vă reproducă rezultatele, ar trebui să raportați modul în care ați testat serul și să înregistrați numărul lotului.
cultură de celule
Prelucrarea celulară
Majoritatea cercetătorilor știu că parametrii culturii au un impact uriaș asupra aplicațiilor lor, dar schimbările în tehnicile de procesare sunt adesea trecute cu vederea.
Poluare
Când celulele sunt izolate din țesut și crescute în laborator, ele nu mai sunt protejate de sistemul imunitar și, prin urmare, sunt extrem de vulnerabile la contaminare.
Prima sursă de contaminare este reprezentată de contaminanții abiotici, cum ar fi impuritățile din mediul de cultură, serul, suplimentele sau apa, precum și endotoxinele și substanțele de filtrare. Precauțiile includ utilizarea apei de laborator pentru experimente de cultură celulară și medii, ser, suplimente și consumabile de la producători care oferă certificare pentru testarea endotoxinelor. În plus, consumabilele trebuie să fie fabricate din polistiren sau polipropilenă virgin pentru a se asigura că aditivii din plastic nu se infiltrează în cultura celulară.
A doua sursă de contaminare sunt contaminanții biologici, cum ar fi bacteriile (inclusiv micoplasmele), ciupercile și drojdia.
fezabilitate
Viabilitatea celulară este definită ca proporția de celule viabile dintr-o probă. Pe lângă contaminanții pe care tocmai i-am văzut, există diverși alți factori care afectează viabilitatea celulelor. Condițiile de mediu – temperatura, pH-ul, presiunea osmotică, disponibilitatea nutrienților și concentrațiile de O2 și CO2 – sunt foarte importante. Majoritatea acestor variabile sunt controlate de mediu și sunt specifice tipului de celule, ceea ce, din păcate, înseamnă că nu putem oferi linii directoare specifice.
Deoarece celulele sunt foarte sensibile la presiune, ar trebui să acordați atenție nu numai condițiilor de mediu, ci și tehnicilor dumneavoastră de manipulare a lichidelor.
Un ultim factor care afectează viabilitatea celulară este senescența. Majoritatea liniilor celulare finite supraviețuiesc între 20 și 60 de diviziuni înainte de a muri, ceea ce înseamnă că pot fi reutilizate doar între 15 și 45 de generații. Ulterior, proba crioconservată trebuie să fie dezghețată din banca de celule. Liniile celulare continue pot prolifera la infinit, dar pentru că sunt predispuse la derive genetică, acestea ar trebui înlocuite în mod regulat.
Testele de detectare folosind metode colorimetrice, fluorometrice și bioluminiscente pot fi utilizate pentru a măsura viabilitatea celulelor. O metodă colorimetrică folosită în mod obișnuit este metoda MTT, care se bazează pe reducerea sărurilor galbene de tetrazoliu la cristale de formazan violet de către celulele vii.
96-plăci de puțuri
automatizare
Multe dintre provocările descrise mai sus pot fi abordate prin automatizarea fluxurilor de lucru ale culturii celulare. De exemplu, manipularea celulelor va fi întotdeauna consecventă, având un impact pozitiv asupra reproductibilității și viabilității. Cel mai important, automatizarea reduce riscul de contaminare a utilizatorului.
În ciuda acestor avantaje, automatizarea întregului flux de lucru poate fi o provocare din motive bugetare, lipsă de spațiu pentru roboți sau pentru că nu există suficiente resurse pentru a automatiza și valida fiecare pas simultan. Dar asta se poate rezolva!