Tehnologia PCR trebuie să aibă sintetizați artificial primeri rezonabili și să extragă probe de ADN, apoi să efectueze cicluri termice automate și, în final, să efectueze identificarea și analiza produsului. În prezent, proiectarea și sinteza amorsei pot fi efectuate doar în câteva institute de cercetare, institute și clinici cu putere tehnică puternică. Aplicația trebuie doar să achiziționeze kitul de detectare PCR pentru a începe lucrul. Există mulți factori de influență în ciclul termic automat PCR. Pentru diferite probe de ADN, cantitatea de diferite componente adăugate în reacția PCR și parametrii ciclului de temperatură sunt inconsecvenți.
Câțiva factori principali de influență sunt acum introduși după cum urmează.
Unul, parametrii ciclului de temperatură
În ciclul termic automat PCR, cel mai critic factor este temperatura de denaturare și recoacere. După cum se arată în exemplul de operare, condițiile de denaturare, recoacere și extindere sunt: 94℃60s, 37℃60s, 72℃120s, un ciclu total de 25~30 A, fragmentul amplificat este de 500bp. Aici, timpul fiecărei etape ar trebui calculat după ce amestecul de reacție atinge temperatura necesară. În termociclorul automat, timpul de la temperatura inițială a amestecului până la temperatura necesară durează 30-60 s. Durata acestui timp de întârziere depinde de mai mulți factori, inclusiv tipul tubului de reacție, grosimea peretelui, volumul amestecului de reacție, căldură. sursă (baie de apă sau bloc de încălzire) și diferența de temperatură dintre cele două trepte, care ar trebui furnizată în mod adecvat la setarea ciclului termic. Acordați atenție și luați în considerare, iar măsurarea efectivă trebuie efectuată pe fiecare instrument.
Un alt aspect important despre timpul ciclului termic este distanța dintre cele două amorse; cu cât distanța este mai mare, cu atât este nevoie de mai mult pentru a sintetiza întreaga lungime a secvenței țintă. Timpul de reacție menționat mai sus se bazează pe lungimea optimă de sinteză de 500 pb. Secvența țintă este întocmită. Iată o introducere în alegerea diferitelor temperaturi.
1. Temperatura de denaturare a șablonului Temperatura de denaturare determină temperatura la care ADN-ul dublu catenar se topește în reacția PCR. Dacă temperatura de denaturare nu este atinsă, nu se va produce niciun șablon ADN monocatenar și PCR nu va începe. Temperatura scăzută de denaturare înseamnă denaturare incompletă, ADN-ul dublu catenar Se va renatura rapid, reducând astfel randamentul. În general, 90~95℃. Odată ce proba atinge această temperatură, ar trebui să fie răcită rapid la temperatura de recoacere. Denaturarea ADN-ului durează doar câteva secunde și nu este necesară mult timp; dimpotrivă, ar trebui să încercați tot posibilul la temperatură ridicată. Scurtați-l pentru a menține activitatea ADN polimerazei Taq. Temperatura maximă de denaturare după adăugarea ADN polimerazei Taq nu trebuie să depășească 95°C.
2. Temperatura de recoacere a primerului Temperatura de recoacere determină specificitatea și randamentul PCR; dacă temperatura este ridicată, specificitatea este puternică, dar dacă temperatura este prea mare, primerul nu poate fi combinat ferm cu șablonul, iar eficiența de amplificare a ADN-ului este redusă; temperatura este scăzută, randamentul este mare, dar prea scăzut poate cauza nepotrivirea amorsului și a șablonului, crește produsele nespecifice. În general, începeți cu condiția de reacție de 37 ℃, configurați o serie de reacții de control pentru a determina temperatura optimă de recoacere pentru o anumită reacție. Se poate deduce, de asemenea, pe baza conținutului (G+C)% al primerilor pentru a înțelege testul. Punctul de pornire al testului general, temperatura de recoacere Ta (temperatura de recoacere) este cu 5℃ mai mică decât temperatura de topire. TTm (temperatura de topire) a primerului de amplificare, care poate fi calculată după formula:
Ta = Tm-5℃= 4(G{{2}}C){{4}} 2(A+T) -5℃
Printre acestea, A, T, G și, respectiv, C reprezintă numărul de baze corespunzătoare. De exemplu, pentru un primer de 20 de baze, dacă conținutul de (G+C)% este de 50%, punctul de pornire al Ta poate fi setat la 55°C. La o concentrație tipică de primer (cum ar fi 0,2 μmol/L), reacția de recoacere poate fi finalizată în câteva secunde și nu este necesară recoacere pe termen lung.
3. Alegerea temperaturii de extensie a primerului depinde de temperatura optimă a ADN polimerazei Taq. În general, 70~75℃, rata standard de nucleotide catalizate de enzime la 72℃ poate ajunge la 35~100 nucleotide/sec. pe minut. Lungimea de 1 kb poate fi extinsă, iar viteza acesteia depinde de compoziția soluției tampon, valoarea pH-ului, concentrația de sare și natura șablonului ADN. Dacă fragmentul amplificat este mai scurt de 150 bp, etapa de extensie poate fi omisă și devine un ciclu de temperatură dublă, datorită Taq ADN polimeraza este suficientă pentru a finaliza sinteza secvențelor scurte la temperatura de recoacere. Pentru fragmente de secvențe scurte între 100 și 300 bp, este eficient să se utilizeze un ciclu rapid și simplu cu dublă temperatură. În acest moment, temperatura de extindere a grundului este aceeași cu temperatura de recoacere. Pentru fragmentele de ADN de peste 1 kb, timpul de extensie poate fi controlat în interval de 1 până la 7 minute, în funcție de lungimea fragmentului. În același timp, gelatină sau reactiv BSA trebuie adăugat în tamponul PCR pentru a menține ADN polimeraza Taq activă și stabilă pentru o lungă perioadă de timp. Sex; 15%-20% glicerol ajută la amplificarea fragmentelor de ADN de aproximativ 2,5 kb sau mai lungi.
4. Numărul de cicluri de PCR convențională este în general de 25 până la 40 de cicluri. Eroarea generală este că numărul de cicluri este prea mare, fundalul nespecific este grav, iar complexitatea crește. Desigur, numărul de cicluri ale reacției este prea mic, iar randamentul este scăzut. Prin urmare, este necesar să se asigure că produsul este obținut. Sub premisa ratei, numărul de cicluri ar trebui redus la minimum.
După ce amplificarea este completă, proba este răcită și depozitată la 4°C.
2. Primer Design Primer
Pentru a amplifica ADN-ul șablon, trebuie mai întâi să proiectați doi primeri oligonucleotidici. Așa-numiții primeri sunt de fapt două fragmente de oligonucleotide care sunt complementare secvenței de ADN țintă care urmează să fie amplificată. Distanța dintre cei doi primeri determină lungimea fragmentului amplificat. , Capetele 5' ale celor doi primeri determină pozițiile celor două capete 5' ale produsului amplificat. Se poate observa că primerii sunt cheia pentru determinarea lungimii, poziției și rezultatelor fragmentelor amplificate prin PCR, iar designul primerului este mai important.
Condiția necesară pentru proiectarea primerului este ca secvența de ADN țintă complementară primerului să fie cunoscută. Secvența dintre cei doi primeri nu este neapărat clară. Cele două secvențe cunoscute sunt în general 15-20 de baze, care pot fi sintetizate cu un sintetizator de ADN. Corespunzând la doi primeri complementari, în plus, principiile urmate în general în proiectarea primerului includ:
1. Lungimea primerului este calculată conform statisticilor, iar probabilitatea ca o secvență de oligonucleotide de aproximativ 17 baze să apară în genomul uman este o dată. Prin urmare, lungimea primerului este în general nu mai mică de 16 nucleotide, iar cea mai mare Nu mai mult de 30 de nucleotide, iar cea mai bună lungime este de 20-24 de nucleotide. Astfel de oligonucleotide scurte nu vor forma un hibrid stabil la temperatura de polimerizare (trecând 72°C). Uneori poate fi la 5' Adăugați secvențe care nu sunt complementare șablonului la sfârșit, cum ar fi situsurile sau promotorii enzimei de restricție, pentru a finaliza clonarea genelor și alte nevoi speciale; primerul 5'marca de biotină de la capăt sau eticheta fluorescentă poate fi utilizată în diverse scopuri, cum ar fi detectarea microbiană.
Uneori, primerul'nu funcționează, motivul este necunoscut, puteți muta poziția pentru a o rezolva.
2. Compoziţia grundurilor cu conţinut de (G+C)% trebuie să fie uniformă şi încercaţi să evitaţi să conţină acelaşi polimer de bază. Conținutul (G+C)% din cei doi primeri ar trebui să fie cât mai asemănător posibil, în fragmentul cunoscut amplificat (G{+C) % conținutul ar trebui să fie aproape de fragmentul de amplificat, în general 40% până la 60% este mai bine.
3. Interiorul grundului ar trebui să evite formarea unor structuri secundare evidente, în special structuri în ac de păr. De exemplu:
4. Nu ar trebui să existe o completare între cei doi primeri între primeri, în special la capătul 3' al primerului. Chiar dacă nu poate fi evitată, baza complementară 3'capătul nu trebuie să fie mai mare de 2 baze, altfel este ușor să se formeze un"dimer de amors" Sau"Dimer de grund" (Primer dimer). Așa-numitul dimer primer este în esență un fragment de ADN dublu catenar format prin extensia unui primer pe cealaltă secvență de primer sub acțiunea ADN polimerazei. , Este un produs secundar comun al PCR și uneori chiar devine produsul principal.
În plus, evitați secvențele omoloage între cei doi primeri, în special fragmentele de oligonucleotide cu mai mult de 6 baze identice consecutive, altfel cei doi primeri vor concura unul cu celălalt pentru același situs al matriței; în mod similar, primerii și ADN-ul țintă de amplificat Sau alte secvențe ale probei de ADN nu pot avea secvențe omoloage de mai mult de 6 baze. În caz contrar, primerii se vor lega de alte situsuri, reducând amplificarea specifică și crescând amplificarea nespecifică.
5. Primerul 3'ADN polimeraza de împerechere finală adaugă o singură nucleotidă la capătul 3'al primerului. Prin urmare, cerințele de împerechere a 5-6 baze de la capătul 3' al primerului și ADN-ul țintă trebuie să fie precise și stricte pentru a asigura o amplificare PCR eficientă. .
Dacă designul grundului este rezonabil, poate fi verificat prin căutare pe computer folosind software-ul PCRDESN și software-ul American PRIMER.
Oligonucleotidele sintetizate artificial ar trebui, de preferință, să fie purificate prin cromatografie (cromatografie) sau PAGE pentru a îndepărta impuritățile, cum ar fi lanțurile scurte care nu au fost sintetizate la lungimea completă. Grunduri purificați păstrați în soluție de acetonitril 25% la 4°C pot preveni microorganismele În circumstanțe normale, amorsele neutilizate trebuie păstrate la frigider la -20°C. Primerii pot fi păstrați în lichid timp de 6 luni și pot fi păstrați timp de 1 până la 2 ani după liofilizare.